微生物实验样本获取及制备指南（上篇） | 16S专题
粪便样本的收集及提取
收集样本：一般对于人的粪便，要求用无菌粪便收集器或其他灭菌器皿收集粪便样本，要注意即刻进行样本标记并低温保存（考虑到患者样本可能无法取样后直接分装标记，可以先在低温条件下保存，尽快进行分装标记）；对于小鼠粪便，分别收取采样小鼠的粪便，立即进行收取，尽量不要暴露在空气中太长时间，避免污染和降解；
分装保存：由于有些样本取样不易，因此我们建议一次收集后分装保存，对于人的粪便，我们建议使用无菌牙签挑取内部样本，尽量排除空气污染及防止样本降解，使用灭菌离心管分别称取0.2g左右的样本，每个样本分装10管左右备用，标记好后即刻放入-80℃保存。当然由于小鼠个体较小，可能粪便样本不足0.2g时，我们可以适当将多个生物学重复样本进行混合，进行保存。
建议：一般来说，每次实验取用一管，用过后将剩余样本丢弃；并且若遇上收集困难或者十分珍贵的样本，请老师注意备份，避免再次收集耗费更大的人力物力，并且无法保证实验条件完全一致，导致后续分析无法达到预期。
土壤样本的收集及提取
样本收集：取样区域一般是根据实验设计进行选择，建议选取具有代表性的土壤；采样时使用的所有工具、采集袋或其他物品均要使用已灭菌的；若野外没有合适的条件进行灭菌处理，可以使用采集的土壤对取样工具进行擦拭，尽量去除干扰；采集时一般选 取 5-10 cm处土壤，去除杂质，将一定量的土壤进行分装标记，每袋样品约5-10 g， 密封后立即低温保存。
建议：土壤取样时时常会碰到杂质含量较高，取样时需要对杂质进行过滤，避免石块等杂质戳破采集袋等情况的发生，也会给后续提取造成干扰；
肠道内容物的收集及提取
样本收集：一般取样时实验对象已死亡（动物），需要使用无菌的解剖刀，尽量在无菌状态下取出整个肠道，将实验所需的肠段的内容物切下，将内容物取出放置在无菌离心管中，建议分装保存，便于后续实验需求，低温保存运输；若是无法立即抽提，建议将样本先置于液氮中冷冻4小时以上，保证冷冻充分再转移到-80℃保存。
建议：由于肠道内容物来源不一，一般来说保存单个样本取样量如下：大型动物，如牛、羊500 mg-1000 mg/管；中型动物，如大鼠、家兔 200-1000 mg/管；小型动物，如小鼠 200-500 mg/管；对于肠道内容物较少动物，如鱼、 虾 ≥100 mg/管。为保证实验顺利进行，在采样允许的情况下，尽量多采集样品。
肠道粘膜微生物的收集及提取
样本收集：实验操作在无菌条件下进行，将整个肠道移出体外，将肠系膜的对面纵向切开，使肠腔外露；使用无菌器械将肠道内容物清理干净后，用无菌生理盐水清洗肠腔，为了避免扰破坏乱肠粘膜，需将看得见的肠道内容物轻轻去除；用无菌载玻片轻刮肠道粘膜（避免穿透基底膜）。所有样品取完后立即放入液氮冷冻，并放在-80℃冰箱保存。
建议：由于肠道黏膜微生物收集要求较多，而采集到的黏膜微生物比较少，建议重复上述步骤多次，但必须在无菌环境下操作，保证足够取样及保存。
生殖道微生物的收集及提取
样本收集：取样对象需48h内无性行为，不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为， 30天内不能用抗生素和抗真菌类药物，以免导致菌群结构变化；取样时用无菌棉签擦拭，充分取样，用无菌剪刀剪下棉签头部，放入装有Amies培养基的无菌离心管中，立即-80℃保存。
建议：生殖道微生物收取不易，样本珍贵，需进行多管备份保存；提取DNA时需先将棉签低温解冻，漩涡处理5min以重悬细胞。
口腔微生物的收集及提取
样本收集：口腔微生物收集可以有两种方法供选择：
（推荐）根据研究目的选定时间段对24h内不刷牙的受试者进行取样；取样前漱口，用无菌金属环轻轻刮取牙齿表面10-20次；将其置于装有1ml盐溶液的1.5ml无菌离心管，盐溶液经过UV照射以避免DNA污染；将样本混合完全后-80℃保存；
根据研究目的选定时间段对24 h内不刷牙的受试者进行取样，使用特定唾液取样器；受试者向取样器中吐2-3次唾液（一次约1 ml）；将配套的DNA稳定剂加到唾液中；密封后，做好样品标记，-80℃保存。由于唾液中含有抑菌成分且宿主DNA过多，不推荐使用此方法。
建议：不同研究目的受试者情况不同，建议取样时进行多管备份保存，以备后续实验需求。
未完待续，由于篇幅有限，样品获取及制备（上篇）就写到这里，下篇还有更多内容的哦~